前言2020 年 5 月 20 日，湖南大学于峰教授和中南林业科技大学林亲录教授作为配合通讯作者，在 Science Advances 杂志（IF: 12.804）在线揭晓了题为“RALF1-FERONIA complex affects splicing dynamics to modulate stress responses and growth in plants ”的研究论文，深入探究了拟南芥响应细胞外信号进而调控 mRNA 可变剪接的机制。文章中转录组测序及可变剪接分析由欧易生物完成。研究配景真核生物基因的可变剪接（AS），富厚了基因的编码能力和转录调控潜能。
植物针对体外信号做出响应，以动态调控基因的可变剪接。拟南芥受体卵白激酶 FERONIA 可以响应其配体 RALF1 小肽信号，调控植物的生长、胁迫响应，影响作物的粮食产量和品质，但 FERONIA 如何响应 RALF1 信号以调控如此多样的细胞内运动仍有待深入研究。本研究从基因可变剪接的角度举行了探究。研究内容本研究在拟南芥中通过转录组测序举行可变剪接分析，效果讲明细胞外信号 RALF1 可以通过其受体 FER 与 GRP7 卵白互作并调控 GRP7 磷酸化，进而促进 GRP7 卵白在细胞核内积累。
FER 依赖的 GRP7 磷酸化促进了其与 mRNA 的联合能力、与剪接复合体成员 U1 的联合，最终动态调控 mRNA 的可变剪接。GRP7 自身的可变剪接，通过 NMD 机制负反馈调控 RALF1-FER-GRP7，精致调控对胁迫的响应与细胞生长。RALF1-FER-GRP7 为植物响应外部刺激引起的 mRNA 剪接调控机制提供了一个范式。
研究效果1. RALF1 调控拟南芥根中基因的可变剪接使用 RALF1 处置惩罚拟南芥 Col-0 的根，举行转录组测序。效果显示，与空缺处置惩罚对照相比，RALF1 处置惩罚后对根中 mRNA 表达量的影响较小，但显著影响了 mRNA 的可变剪接（AS）。共检测到 3401 个显著差异的 AS 事件（左上图），GO 分析讲明发生 AS 改变的基因主要到场 DNA 修复、氨基酸合成、胁迫响应、根细胞分化等历程（左下图）。随机选择其中 20 个 AS，，其中 16 个可以使用 semi-PCR 得以验证（右图）。
接下来，为了证明 RALF1 是否通过剪接复合体影响了 AS，划分在剪接复合体突变的 sr45-1 和 lsm8-1、以及 RALF1 受体突变的 fer-4 中举行了检测，效果显示这些突变体中 RALF1 导致的根生长抑制现象均泛起一定水平的缓解（下图）。同时实验证实 RALF23 可以起到与 RALF1 类似的根生长抑制作用。2. FER 与 GRP7 卵白相互作用在 RALF1 受体突变体 fer-4 中，对上述受到 RALF1 调控的 AS 举行检测，均显示 AS 的改变不显著，这讲明 RALF1 通过其受体 FER 调控可变剪接。
酵母双杂交筛选、GST pull-down 和 BiFC 实验讲明，FER 可以与 GRP7 卵白直接相互作用（下图）。3. RALF1 通过 FER 调控 GRP7 的磷酸化水平使用 ABA 诱导的体外磷酸化系统检测显示，FER 可以介导 GRP7 的 6 个氨基酸残基发生磷酸化。GRP7 的磷酸化水平随 RALF1 处置惩罚而升高，但在 fer-4 突变体中 GRP7 磷酸化不受 RALF1 影响（下图 B）。
同时使用 label-free 检测显示 RALF1 在体内主要影响了 GRP7 Ser132 和 Ser139 位点的磷酸化（下图 C-D）。4. RALF1-FER 通过 GRP7 调控可变剪接为了研究 GRP7 是否到场了 RALF1 介导的 AS 改变，对 Col-0、fer-4 以及 grp7-1 8i 举行了转录组测序，其中 grp7-1 8i 是一个带有 GRP8 RNAi 载体的 grp7-1 T-DNA 插入突变体。与 Col-0 对照相比，fer-4 中共筛选到 3509 个显著的 AS 事件，grp7-1 8i 中共筛选到 3822 个显著的 AS 事件，有 1164 个 AS 事件同时存在于两组差异效果中，而且两组比力间大部门 AS 差异的趋势相同（下图）。
GO 富集分析显示两组配合差异的 AS 主要到场胁迫响应和发育。12 个 AS 中的 11 个可以通过 semi-PCR 得以验证。同时分析显示，FER、GRP7 突变体中与 RALF1 处置惩罚所引起的 Col-0 中 AS 高度一致，讲明 RALF1 所引起的 AS 改变部门通过 FER 和 GRP7 来实现。
5. RALF1-FER 通过 FER 介导的 GRP7 磷酸化调控可变剪接RALF1 处置惩罚会抑制植物的根长，而在 fer-4 和 grp7-1 8i 突变体中，对 RALF1 引起的根长抑制变得不敏感。grp7-1 8i 中过表达 GRP7 后能够恢复根长对 RALF1 的响应。
在 grp7-1 8i 突变体配景下过表达磷酸化失活突变的 GRP7mut6A，不能够恢复根长对 RALF1 的响应；而在 grp7-1 8i 突变体中过表达磷酸化激活的 GRP7mut6A ，根长相比对照而言对 RALF1 更为敏感（图 D），这讲明 FER 介导的 GRP7 磷酸化在 RALF1 响应中至为关键，活性氧反映（图 E）同时验证了上述结论（图 F）。ABA 处置惩罚（图 G）也讲明，GRP7 和 FER 到场调控植物的胁迫响应，而这一历程同样依赖于 GRP7 的磷酸化。亚细胞定位显示，RALF1 处置惩罚会导致 Col-0 中 GRP7 在细胞核积累（图 A-B），而 RALF1 处置惩罚的 fer-4 突变体中 GRP7 在细胞核积累不显著。
同样，无论是否经 RALF1 处置惩罚，磷酸化位点失活突变的 GRP7mut6A 拟南芥中 GRP7 也较少漫衍于细胞核中。这讲明 RALF1-FER 途径促进了 GRP7 在细胞核中的积累，而且这一历程部门依赖于 FER 介导的磷酸化。酵母双杂交与 BiFC 实验讲明，GRP7 可以在细胞核中与剪接复合体的成员 U1 互作（图 C-D）。
EMSA 实验检测讲明，GRP7 可以联合到 PUB9、ABF1、LRK10L1.1 mRNA，这些基因都是 ABA 相关基因而且都具有 GRP7 联合 motif。磷酸化的 GRP7 与 mRNA 的联合能力更强（上图 F）。RIP 实验也证实，GRP7 在体内也具有与 mRNA 联合能力，但在 fer-4 突变体中联合能力较弱，RALF1 处置惩罚可以增强 GRP7 与 mRNA 的联合（上图 G）。
以上效果说明 RALF1 通过促进 FER 介导的 GRP7 磷酸化介导了 GRP7 与 mRNA 的联合能力。6. RALF1-FER-GRP7 调控的可变剪接的作用为了研究 RALF1-FER-GRP7 介导的可变剪接的作用，选择 ABA 信号途径中的转录因子 ABF1 为研究目的。
前述转录组测序数据显示 ABF1 有两个转录本，其中 ABF1.1 编码 392 个氨基酸，ABF1.2 编码 403 个氨基酸。在 fer-4 和 grp7-1 8i 突变体中，ABF1.1 表达量上升，而ABF1.2 表达量下降，说明 FER 和 GRP7 影响了 ABF 的可变剪接。与对照相比，在 wt 中过表达 ABF1.2 会使拟南芥出现 ABA 抗性，而过表达 ABF1.1 会使拟南芥对 ABA 更为敏感（图 C-D）。
说明 RALF1-FER-GRP7 调控的可变剪接影响对 ABA 的应答。7. GRP7 AS 转录本表达水平受到 NMD 机制调控无义介导的 mRNA 降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）作为真核生物体内的重要调控机制，可以介导可变剪接发生的错义转录本降解。GRP7 也可以通过 NMD 机制举行调控。
GRP7 有一个保留了部门内含子的可变转录本 as_GRP7，会导致 GRP7 翻译的提前终止，无法发生有功效的卵白，最终被 NMD 机制降解。Semi-PCR 显示，相比对照，as_GRP7 在过表达突变型 GRP7mut6D 和野生型 GRP7 中表达水平升高，而在过表达 GRP7mut6A 突变型中表达水平降低，讲明 GRP7 的过磷酸化会触发 as_GRP7 发生，而 as_GRP7 有可能会对 GRP7 的卵白发生负反馈调控。ABA 处置惩罚后，GRP7 卵白水平会显著降低，究其原因发现 ABA 处置惩罚后虽然 GRP7 RNA 水平总体上升（图 B），可是 as_GRP7 上升显著，导致 mRNA 降解，引起了卵白水平的下降（图 C）。由此可以推断 ABA 同样可以通过 NMD 机制动态调控了 GRP7 的表达水平。
研究结论基于以上效果，本研究提出了拟南芥响应细胞外信号调控 mRNA剪接的作用机制：细胞外信号 RALF1 通过其受体 FER，与 GRP7 联合并介导其磷酸化，磷酸化的 GRP7 在细胞核内积累并与可变剪接复合体联合调控了 mRNA 的可变剪接。而 GRP7 自身也由于发生可变剪接受到 NMD 机制的调控以维持动态平衡，精致调控植物对胁迫的响应。· 作者简介林亲录，中南林业科技大学食品学院院长，二级教授，树人学者特聘教授；稻谷及副产物深加工国家工程实验室主任；中组部万人计划人才，国家重点领域“大米深加工与综合使用”创新团队首席专家，课题组近年来团结湖南大学围绕水稻逆境及品质调控研究揭晓论文多篇。
于峰，湖南大学生物学院教授，博士生导师，副院长，青年长江学者。课题组恒久围绕植物情况适宜性机制开展深入研究，该课题组近两年来相继在 PLOS Biology（点击链接检察详情）、Molecular Plant、New Phytologist 等期刊上揭晓论文多篇。汪龙，湖南大学首届良好博士后，博士结业于中南林业科技大学（导师：林亲录），2018年7月进入湖南大学生物学院开展博士后训练（互助导师：于峰）。以第一作者/并列第一作者在Science Advances, Journal of Experimental Botany等揭晓论文7篇，授权专利4项。
主持中国博士后基金面上项目1项。参考文献Wang L, Yang T, Wang B, et al. RALF1-FERONIA complex affects splicing dynamics to modulate stress responses and growth in plants. Sci Adv 2020; 6(21): eaaz1622.猜你想看4月 | 34 篇互助文章为你揭秘发文思路项目文章 | 乳果糖通过肠道菌群缓解盐敏感型高血压的机制项目文章 | Molecular Cancer：circCCDC9 通过 ceRNA 机制抑制胃癌希望项目文章 | 欧易客户发现RALF1信号转导中EBP1负向调控作用的分子机制END 本文系欧易生物原创转载请注明本文转自欧易生物。
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